2022年11月检验医学院谢国明教授团队在国际知名学术期刊Nucleic Acids Research报道了一种新型的CRISPR/Cas12a超特异性激活模式。近日，该团队又在该期刊上发表了题为“Unmodificated stepless regulation of CRISPR/Cas12a multi-performance”研究成果。该研究提出一种无修饰的CRISPR/Cas12a多种性能无级调控策略，实现了对多种CRISPR/Cas12a特性的细粒度和可预测控制，将进一步解决快速发展和精细划分的分子生物学领域更加多样化和细致性不足的问题。

聚集规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的革命性技术深刻改变了分子生物学领域。然而，随着应用范围的不断扩大，仅凭CRISPR/Cas的固有性能已不足以满足越来越多细分应用的多样化需求。如何精细调控CRISPR/Cas的多项性能(活性、速度、特异性、编程性、拓展性、灵敏度等)以更好地满足不同的需求逐渐成为研究的重点。

这项研究在CRISPR/Cas12a体系中引入了基于TMSD的额外RNA附件（ERA）工具包，这些ERA不会激活Cas12a,但能与crRNA的部分space区域结合形成具有toehold的双链结构，让激活剂与crRNA的简单配对结合转变为由TMSD决定的有条件的反应（ERA作用等同于“protecter”）。通过附加不同长度，不同结构，不同错配的ERA能相应地改变ERA-crRNA复合物与激活剂反应的动力学和热力学，从而允许精确地控制Cas核酸酶的激活程度，进而允许掌控包括活性、速度、特异性、编程性、拓展性、灵敏度等多项性能。此外，作者还通过附加ERA实现了空间连续但时间隔离的CRISPR激活控制，从而克服了等温一锅法检测中CRISPR/Cas信号输出模块与扩增模块的互斥难题，进一步提高了等温一锅法检测的灵敏度和信噪比，展现了精细控制CRISPR性能的巨大潜力。

原理图. (A)基于组件修饰和改造实现CRISPR/Cas性能的粗略调节

(B)基于ERA工具箱实现CRISPR/Cas诸多性能的精细调控

入侵链与底物toehold的结合是TMSD的启动步骤，也是反应动力学的关键限速因素。作者首先设计了不同方向、不同长度、不同错配的ERA，以探索CRISPR体系中crRNA、ERA、DNA activator的TMSD是否存在类似的toehold限速规律，研究表明ERA控制的Cas12a活性规律与传统TMSD高度一致。

随后，作者分别将TMSD和TE作为激活的前置条件,探讨ERA工具箱能否在完全不修饰crRNA的情况下显著增强CRISPR/Cas的单碱基特异性。结果表明，TMSD和TE的特异性鉴别规律同样适用于ERA控制的Cas12a，也证明了ERA控制的CRISPR/Cas与高度可编程的核酸纳米技术极为兼容。

最后，作者尝试基于核酸纳米技术的编程性，解决一锅法中INA扩增模块和CRISPR信号放大模块的互斥难题。作者发现ERA辅助的一锅法既能延迟Cas12a激活，使INA和CRISPR程序自动地从时间上隔离，争取扩增时长，提高一锅法最终的激活效率，又能保留一定的反切活性，抑制PER泄露，实现更佳的信噪比（S/N）。

总的来说，这是一种可控制CRISPR/Cas12a多种性能的简单而强大的策略。该策略消除了对Cas蛋白或crRNA组分进行修饰的需要，利用核酸纳米技术的强大可编程性，基于可定制的ERA工具箱，实现对多种CRISPR/Cas12a特性的细粒度和可预测控制，能够满足快速发展和精细划分的分子生物学领域更加多样化和细致的需求。

该研究由重庆医科大学检验医学院谢国明教授课题组和陈婷梅教授课题组合作完成，谢国明教授、陈婷梅教授与吕科博士后为本文通讯作者，硕士研究生赵蓉与博士研究生罗旺为本文共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金面上项目、重庆市自然科学基金项目的资助。

原文链接： https://doi.org/10.1093/nar/gkad748